蛋 白 A 通 常 用 于 人（除 IgG3 夕 h 小 鼠 IgG1 結合力也較弱）、兔 、豚鼠和豬抗體的純化。 材 料腹 水 或 M Ab上 清（單 元 1. 4) PBS, pH8. O和pH7. 3 lmol/L NaOH 蛋 白 A 交聯瓊脂糖凝膠CL-4B (Pharmacia Biotech或 Sigma) 0.lmol/L 檸檬酸， pH 按照所分離的抗體亞類的需要而定（步 驟 3) 1 0 % (m/V) NaN3 (可選） V 硼 酸 鹽 緩 沖 液（可選） 3mol/L 過濾后的硫氰酸鉀 玻 璃 棉（Polysciences) Sorvall離心機， SS-34型 轉 子（或類似轉子）， 4°C 0.45um濾器，過 濾 MAb上清 透析袋 1.5 cmX10 cm層 析 柱（如鋪有玻璃棉的IOml注射器） 組分收集器 蠕 動 泵（可選） Ia 適用于腹水：用玻璃棉去除腹水中脂類（見 基 本 方 案 1 ，步 驟 la)，用 1 0 倍體積的PBS， pH8.0稀釋腹水。 Ib. 適 用 于 MAb上清：于 4°C將 M Ab上 清 以 20 OOOg離心后 用 0 ?45um濾器過濾。對于 IgG1 抗 體 ，用 透 析（對 pH8. 0 PBS) 或者加 入lmol/L NaOH的方法調整其PH到 8.0。對于其他抗體亞類則調整到pH7. 4 。 2.將 蛋 白 A 交 聯 瓊 脂 糖 凝 膠 CL-4B 裝 入 1.5 cm X 10 cm層 析 柱 中 ，連上組分收集器(CPI附 錄 31)。于 4°C 或 室 溫 下 用 PBS， pH8 . 0 平衡層析柱。上 樣（Im l至幾升），當上樣量大時，可用螭動泵或重力幫助上樣。每 毫 升 膠 可 結 合 約 5 mg小 鼠 IgG或8 mg人 IgG。用 流 式 細 胞 儀（單 元 4.1、單 元 4. 2 ) 或 ELISA (單 元 1 . 1 ) 檢測流出的未結合組分中的抗體活性，以判斷上樣量是否過量。 也可選擇使用HiTrap A 蛋白子頁裝柱（ Pharmacia Biotech或Sigma)。 3.用 數 倍 柱 體 積 的 PBS， pH8 . 0 洗 柱 ，一 直 洗 到 A28q到 基 線 水 平 。用 適 當 p H 的0.lmol/L檸 檬 酸 緩 沖 液（用 lmol/L NaOH調 整）洗 脫 目 的 蛋 白 ：小 鼠 IgG1 用pH6. 5 、 IgG2a用 pH4. 5、 IgG2b和 IgG3 用 pH3. 0。低 pH會損傷抗體，因此洗脫前在收集管內按每毫升洗脫液加入5〇 4 2mol/LTris-HCl緩沖液，用于立刻中和酸。 4.合并含目的蛋白的組分，將合并組分倒入透析袋，用 含 或 不 含 有 0 . 0 2 % NaN3 的 IL PBS (pH7. 3 ) 透析，期間更換二次透析液，然 后 置 于 4°C 保 存 。必 要 時 可 用 SDSPAGE進行純度鑒定。 5.層析柱可以先用1 倍柱體積的過濾后的3mol/L 硫氰酸鉀清洗，然后再用數個柱體積的 PBSpH7.3洗柱，最后保存于4°C 。 展 | 