ELISPOT技術原理
在免疫學領域中，對于疾病以及疫苗研究不僅僅局限于體液免疫應答（B細胞免疫），細胞介導的免疫應答(cell mediated immune response，CMI)也是人們所關注的，而T細胞在CMI中起關鍵作用。在研究免疫應答機制時以往常用用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測體液中游離的細胞因子（CK）或抗體，但由于游離的循環抗體或CK的半哀期不同，使之在體液中不斷的被代謝或與靶器官結合，而不能確切的反映體內的抗體及CK的水平。 80 年代，國外的科研工作者根據 ELISA 技術的基本原理，建立了體外檢測特異性抗體分泌細胞和 CK 分泌細胞的固相酶聯免疫斑點技術（ ELISPOT ）。作為一項新型的免疫酶技術——酶聯免疫斑點法(enzyme linked immunospot assay，ELISPOT)，是從單細胞水平檢測分泌抗體細胞(ASC) 或分泌細胞因子(CK) 細胞的一項細胞免疫學檢測技術。由于該方法具有較高的特異性和敏感性，易操作，成本相對流式細胞分析術也較低，已被廣泛用于分泌CK細胞檢測或ASC測定中，對探索自身免疫系統疾病發病機制具有重要意義。
ELISPOT 法源自 ELISA，又突破傳統 ELISA 法，是定量 ELISA 技術的延伸和新的發展。兩者都是檢測細胞產生的細胞因子或其他可溶性蛋白，它們最大的不同在于：
（1） ELISA通過顯色反應，在酶標儀上測定吸光度，與標準曲線比較得出可溶性蛋白總量。
（2） ELISPOT也是通過顯色反應，在細胞分泌這種可溶性蛋白的相應位置上顯現清晰可辨的斑點，可直接在顯微鏡下人工計數斑點或通過ELISPOT 分析系統對斑點進行計數，1個斑點代表1個細胞，從而計算出分泌該蛋白的細胞的頻率。（某些研究不僅要測細胞因子生成量，還需檢測分泌此細胞因子的細胞頻率）
由于是單細胞水平檢測， ELISPOT 比 ELISA 和有限稀釋法等更靈敏，能從20萬-30萬細胞中檢出1個分泌該蛋白的細胞。捕獲抗體為高親和力、高特異性、低內毒素單抗，在研究者以刺激劑激活細胞時，不會影響活化細胞分泌細胞因子。
下面將從發展、原理、具體實驗操作、技術優勢和應用幾方面進行介紹。
ELISPOT技術的發展
（1） ELISPOT技術的過去
ELISPOT是20多年前便己研發成功的老技術。Czerkinsky 等人率先在1983年，運用該技術成功地檢測出因受激而分泌抗體的B細胞頻率。從那時起世界各國免疫學者便開始一長期的ELISPOT Cytokine技術競賽，每個團隊都希望能率先將此一技術推廣來研究T細胞免疫，其絕妙之處在提供一接近體內實驗的環境，藉由偵測T細胞分泌的各類細胞因子，來定量機體內免疫反應啟始者Precursor T的clonal size族群大小，同時預測體內免疫系統即將進行的下游免疫反應。
ELISPOT Cytokine技術雖說操作簡單，但該技術并沒能如預期地很快地被成功應用在ex vivo T細胞功能研究。要讓ELISPOT技術從B細胞免疫走向T細胞免疫的產生的第一個主要問題，便是靈敏度的提升，因為T細胞因子較之B細胞免疫球蛋白產量極少。早期ELISPOT的分析條件不是非常理想，成對抗體的品質、呈色底膜的材質等幾個技術性的問題，使當時多數研究團隊很難獲得清晰的斑點，結果是敏感度不夠、數據分析重現性低。這問題直到1996美國俄亥俄卅Case Western Reserve大學Paul Lehmann團隊引進PVDF薄膜的應用（Forsthuber et al., Science, 1996），才釜底抽薪地解決了該技術因斑點呈色問題造成低敏感度的缺失。與原來的標準膜面相比，PVDF薄膜提供1,000倍的較大面積來吸附單株抗體，使T細胞分泌的各類細胞因子能在細胞周圍就近被俘虜，讓呈色斑點集中、清晰、對比色高，大大的提高ELISPOT Cytokine分析的敏感度。圖一是使用PVDF-BASED改良薄膜（Panel A）與傳統標準薄膜（Panel B）并行實驗的比較結果。同樣的人體 PBMC樣品，在通過完全相同的實驗，Panel A呈現較清晰的小色點。
第二個技術性問題是ELISPOT Cytokine實驗分析的幾個基本假設缺乏科學實證，也使得該技術在當時并沒受到該有的廣泛重視。沒有科研人員嘗試去厘清一些基礎但很重要的問題，諸如：
實驗所得的斑點是抗原特定T細胞所生產，還是旁觀細胞受Cytokine刺激的次級效應？
斑點的小或大有何生理意義；如何決定cutoff值？
能否相信斑點是由單一的細胞造成？
ELISPOT Cytokine分析技術能準確測量的頻率范圍？
如果效應相互拮抗的cytokine同時產生，它們是否會互相妨礙？及到什么程度？