從自然環境中分離和純化噬菌體實驗

因為噬菌體是專性寄生物，所以自然界中凡有細菌分布的地方，均可發現其特異的噬菌體的存在，亦即噬菌體一般是伴隨著宿主細菌的分布而分布的，例如糞便與陰溝污水中含有大量大腸桿菌，故也能很容易地分離到大腸桿菌噬菌體；乳牛場有較多的乳酸桿菌，也容易分離到乳酸桿菌噬菌體等。雖然近年的研究表明，自由噬菌體顆粒可以獨立的存活（當然不能生長），對自然條件有一定的耐受能力，又受到自然流動的散布，不一定總是和其宿主細菌同時存在，但沒有宿主細菌的地方，其特異噬菌體的數量畢竟比較少。

由于噬菌體 DNA（或 RNA）侵入細菌細胞后進行復制、轉錄和一系列基因的表達并裝配成噬菌體顆粒后，通過裂解宿主細胞或通過「擠出（exclude）」宿主細胞（宿主細胞不被殺死，如 M13 噬菌體）而釋放出來。因此：

1. 在液體培養基內可使混濁的菌懸液變為澄清或比較淸，此現象可指示有噬菌體存在；也可利用這一特性，在樣品中加入敏感菌株與液體培養基，進行培養，使噬菌體增殖、釋放，從而可分離到特異的噬菌體；

2. 在有宿主細菌生長的固體瓊脂平板上，噬菌體可裂解細菌或限制被感染細菌的生長從而形成透明的或混濁的空斑，稱噬菌斑，一個噬菌體產生一個噬菌斑，利用這一現象可將分離到的噬菌體進行純化與測定噬菌體效價。

本實驗是從陰溝污水中分離大腸桿菌噬菌體，剛分離出的噬菌體常不純，如表現在噬菌斑的形態。大小不一致等，然后再作進一步純化。

大腸桿菌

裝三倍濃縮的普通肉膏蛋白胨液體培養基試管液體培養基上層瓊脂培養基底層瓊脂平板

滅菌玻璃涂棒滅菌吸管無菌濾器（孔徑 0.22 um）恒溫水浴箱真空泵

1. 噬菌體的分離

1.1 制備菌懸液

37℃ 培養 18 h 的大腸桿菌斜面一支，加 4 ml 無菌水洗下菌苔，制成菌懸液。

1.2 增殖培養

于 100 ml 三倍濃縮的肉膏蛋白胨液體培養基的三角燒瓶中，加入污水樣品 200 ml 與大腸桿菌懸液 2 ml，37℃ 振蕩培養 12～24 h。

1.3 制備裂解液

將以上混合培養液 2500 r/min 離心 15 min。

將無菌濾器用無菌操作安裝于滅菌抽濾瓶上，常規操作連接真空抽濾裝置。將離心上清液倒入濾器，開動真空泵，過濾除菌。所得濾液經 37℃ 培養過夜，以作無菌檢査。

液體抽濾完畢，應打開安全痕的放氣閾增壓后再真空泵，否則將產生濾液回流，污染真空泵。

1.4 確證試驗

經無菌檢査沒有細菌生長的濾液作進一步證實噬菌體的存在。

1.4.1 于肉膏蛋白胨瓊脂平板上加一滴大腸桿菌懸液，再用滅菌玻璃涂櫸將菌液涂布成均勻的一薄層。

1.4.2 待平板菌液干后，分散滴加數小滴濾液于平板菌層上面，置 37℃ 培養過夜。如果在滴加濾液處形成無菌生長的透明噬菌斑，便證明濾液中有大腸桿菌噬菌體。

2. 噬菌體的純化

2.1 如已證明確有噬菌體存在，則用接種環取濾液一環接種于液體培養基內，再加入 0.1 ml 大腸桿菌懸液，使混和。

2.2 取上層瓊脂培養基，溶化并冷卻至 48℃（可預先溶化、冷卻，放 48℃ 水浴箱內備用），加入以上噬菌體與細菌的混合液 0.2 ml，立即混勻。

2.3 并立即倒入底層瓊脂平板上，鋪勻，置 37℃ 培養 24 h。

2.4 此法分離的單個噬菌斑，其形態、大小常不一致，需要進一步純化，噬菌體純化的操作比較簡單，通常采用接種針（或無菌牙簽）在單個噬菌斑中刺一下，小心采取噬菌體，接入含有大腸桿菌的液體培養基內，37℃ 培養。

2.5 待管內菌液完全溶解后，過濾除菌，即得到純化的噬菌體，

以上 2.1、2.2、2.3 三步驟，目的是在平板上得到單個噬菌斑，能否達到目的，決定于所分離得到的噬菌體濾液的濃度和所加濾液的量，最好在做無菌試驗的同時，由教師先做預備試驗，若平板上的噬菌斑連成一片，則需減少接種量（少于一環）或增加液體培養基的量；若噬菌斑太少，則增加接種量。

3. 高效價噬菌體的制備

剛分離純化所得到的噬菌體往往效價不高，需要進行增殖。

將純化了的噬菌體濾液與液體培養基按 1：10 的比例混合，再加入大腸桿菌懸液適量（可與噬菌體濾液等量或 1/2 的量），培養，使增殖，如此重復移種數次，最后過濾，可得到離效價的噬菌體制品。