從瓊脂糖凝膠中純化PCR片段實驗

乙醇 溴化乙錠 電泳緩沖液 PCR 片段 瓊脂糖凝膠 細胞和組織

微量離心管 解剖刀 紫外燈 真空裝置

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

（1）乙酵（95%)

（2）嵌入染料，如溴化乙錠

（3）TAE 電泳緩沖液

         40 mmol/L 三羥甲基氨基甲烷-醋酸鹽,pH8.2

         1mmol/LEDTA

或（4）TBE 電泳緩沖液

         90 mmol/L 三羥甲基氨基甲烷-硼酸鹽,pH8.3

         2 mmol/LEDTA

2. 核酸和寡核苷酸

來自瓊脂糖凝膠中的 PCR 片段

3. 膠

瓊脂糖凝膠（常規或低熔點）

4. 特殊設備

微量離心管，1.5 ml

解剖刀或剃須刀片

長波長紫外燈

真空裝置和真空適配器（Promega; 用于真空純化）

5. 其他

WizardSV 膠和 PCR 純化系統（Promege; 包括 SV 微型柱、收集管、膜結合溶液、膜洗滌溶液和無核酸酶的水）

6. 細胞和組織

用于純化的 PCR 樣品

二、方法

應穿戴標準安全服，尤其是處理由溴化乙錠染過的瓊脂糖凝膠時，要戴手套和一個用于保護眼和臉免受紫外線傷害的紫外屏蔽面罩。

1. 凝膠的溶解

（1）將 PCR 樣品上到瓊脂糖凝膠的泳道內，根據已有方法進行電泳。

（2）用于存放凝膠的 1.5 ml 微量離心管要逬行稱量并記錄重量。

（3）利用長波長紫外燈和染料如溴化乙錠使 DNA 成像并拍照。為減少 DNA 形成缺口，盡量縮短對凝肢的照射時間（GrundemannandSchomig1996;Zimmermanneta!.1998)。使用干凈的解剖刀或剃須刀片將含有目的 DNA 片段的瓊脂糖凝膠切下，凝肢的體積要盡可能小。將凝膠轉移到已稱重的微量離心管中，稱重并記錄質量后，從總質量中減去空管的質量以得到凝膠塊的質量。

（4）按照每 10 mg 瓊脂糖凝膠需 10ul 溶液的比例加入膜結合溶液。

（5）振蕩混合物并于 50~65°C：下溫育 l0min 直到凝膠徹底溶解，每數分鐘便振蕩試管次以提高瓊脂糖凝膠熔化的速度，室溫下短時間離心試管以確保內容物位于試管底部。瓊脂糖凝膠一旦熔化，便不會在室溫下重新凝固。

(6) 用離心或真空過濾法可將 DNA 純化。

2. 離心法純化 DNA

(1) 在每一目的片段對應的收集管中放置一個 SV 微型柱。

(2) 將已溶解的凝膠混合物轉移到 SV 微型柱中，室溫下保溫 lmin。

(3)1000g 離心1min，取出微型柱后，棄收集管內液體，將微型柱放回到收集管。

(4) 向微型柱中加入 700ul 膜洗滌液，10000 g 離心 lmin 來洗滌微型柱。用前述方法倒空收集管，將微型柱放回收集管，用 500ul 膜洗滌液重復洗柱，l0000g 離心 5 min。

(5) 小心取出微型柱避免濾過物弄濕柱的底部，若柱已變濕，倒空收集管后重新離心 1min。

(6) 將微型柱轉移到一個干凈的 1.5 ml 微量離心管中，直接向柱的中央加 50ul 無核酸酶的水，勿將移液管吸頭觸到膜上。室溫下保溫1min 后，10000 g 離心1min。

(7) 棄微型柱，于 4°C 或-20°C 保存洗脫 DNA。

3. 真空法純化 DNA

(1) 向對應于每個含有目的片段的凝膠或 PCR 樣的真空裝置的端口系一個帶有 Luer-Lok裝置的真空適配器，然后在每個真空適配器中插入一個 SV 微型柱使其緊貼于其空適配器。

(2) 將溶解的凝肢混合物或 PCR 擴增反應混合物轉移到微型柱中，室溫下溫育 1min, 通過抽真空來推動液體完全通過微型柱。

(3) 向微型柱中加入 700ul 膜洗滌液以洗滌微型柱，要確保所有來自上一步的留在微型柱壁上的小液滴被徹底洗去，通過抽真空推動液體完全通過微型柱后，用 500ul 膜洗滌液進行第二次洗滌。

(4) 停止抽真空，打開一個未使用端口以取出真空裝置。從真空裝置中取出微型柱，將其轉移到一個收集管中，l0000 g 離心 5 min 以去除所有殘留的旗洗滌液。

(5) 將微型柱轉移到一個干凈的 1.5 ml 微董離心管中，直接向柱的中央加 50ul 無核酸酶的水，勿接觸到膜。室溫下保溫 1 min,10000 g 離心 1min。

(6) 棄微型柱，于 4°C 或-20°C 保存洗脫 DNA。