人類細胞中巴氏小體的觀察實驗

實驗方法原理 在性染色體發生畸變時,XXX核型的女性體細胞中可觀察到兩個巴氏小體(圖12-1),即除一條X染色體具有正常活性外,其余的X染色體均失活,而在具47,XXY核型的男性體細胞中,也可觀察到巴氏小體。對巴氏小體的研究有助于揭示X連鎖基因的調控機理、性染色體的進化過程以及解釋性染色體畸變患者的癥狀表現等。

實驗材料 人類口腔黏膜細胞、 毛根鞘細胞等

試劑、試劑盒 甲醇冰醋酸50%、70%、75%、95%乙醇及無水乙醇乙醚50%醋酸溶液5mol L鹽酸磷酸緩沖液1%硫堇水溶液

儀器、耗材 顯微鏡 ( 包括熒光顯微鏡) 恒溫水浴鍋 壓舌板 鑷子 載玻片及蓋玻片

實驗步驟

1.取材及制片。口腔黏膜細胞:先讓受檢者用水漱口數次,以盡可能去除口腔內雜物,然后用醫用壓舌板刮取受檢者口腔頰部黏膜,將刮取物在載玻片上涂片,晾干。

毛根鞘細胞:取受檢者帶毛根鞘的毛發一根,放在一干凈的載玻片上。在根部加一滴50%醋酸溶液,靜置5min,待毛發軟化后,用干凈針頭將根部組織刮下,去毛干,并用針頭將刮下的組織均勻分開,晾干。

2.將制片置甲醇-冰醋酸(3∶1)固定液中20min。

3.將載玻片依次放入95%、70%、50%乙醇及蒸餾水中,每次2～3min。

4.置5mol/L鹽酸中水解約5s。在此過程中RNA被分解,富含RNA的小體也會被硫堇染色。這一步驟十分關鍵,酸解不夠不能除去RNA,酸解過度又會破壞DNA。

5.蒸餾水漂洗2～3次,每次10～15s。

6.硫堇染色10～20min,蒸餾水漂洗,晾干即可鏡檢。如染色太深則可在95%乙醇中分化30s左右,如太淺可復染。人毛根鞘細胞制片可直接用硫堇水溶液染色后,移入75%乙醇中約30s,輕輕擺動,取出晾干即可。

選擇細胞核較大、染色清晰、輪廓清楚的細胞100個,統計X染色質的出現頻率。X染色質位于細胞核膜的內側,輪廓清晰呈平凸形、三角形或卵圓形,顏色為深藍色,直徑1～1.5μm。陽性涂片至少15%的細胞含X染色質,一般不超過30%～35%。來自男性的涂片偶爾也可觀察到X染色質,但出現頻率低于2%。