（5）垂死的腫瘤細胞釋放的PGE2促進TRC的增殖
如前所述，垂死的腫瘤細胞能促進報告細胞的增殖，這暗示著TRCs被除了外泌體miR-194以外的物質驅使加速了增殖。眾所周知，受輻射的垂死腫瘤細胞還釋放了PGE2，這是一種脂質代謝產物，被認為是化學放療后腫瘤重生的重要介質。因此，作者通過ELISA定量了受輻射的垂死胰腺癌細胞中的PGE2，發現放射后24小時PGE2含量保持不變，但在48小時略有升高，而在72小時顯著增加（圖5a）。
同樣，PGE2形成的關鍵酶PTGS2（COX-2）的表達也經歷了短暫的滯后階段，之后逐漸增加（圖5b-c）。而輻射后，胰腺癌細胞中，外泌體相關蛋白（如RAB27A，TSG101和CD9）的表達立即增加（圖5c）。值得注意的是，當COX-2的表達逐漸增加時，外泌體相關蛋白的表達減少（圖5c）。在PDX小鼠模型中，IHC染色還顯示，放射后不久，外泌體相關蛋白的表達升高，直到12天后下降，此時COX
2的表達開始顯著上調（圖5d）。
同時，發現
celecoxib（一種抑制PGE2合成的COX-2抑制劑）以劑量依賴性方式顯著抑制了腫瘤細胞的繁殖（圖5e）。雖然PGE2可以加速腫瘤細胞的增殖，但是在放射后立即向腫瘤細胞中添加PGE2會反向抑制細胞活力（圖5f）。值得注意的是，celecoxib處理并不會影響外泌體相關標志蛋白質的表達（圖5g）。這些結果表明，輻射的垂死腫瘤細胞分泌的外泌體對于腫瘤的再形成至關重要。
綜上，這些結果表明，垂死的腫瘤細胞釋放的外泌體和PGE2共同作用導致了腫瘤的再增殖級聯反應，其中外泌體miR-194-5p首先抑制細胞增殖以促進TRC的恢復，然后PGE2促進TRC的加速增殖。
圖5：垂死的腫瘤細胞釋放的PGE2促進回收的TRC的增殖
（6）阿司匹林通過削弱垂死的腫瘤細胞的分泌物來抑制放療后的腫瘤
作者前期研究推測，阿司匹林可能具有抑制胰腺癌中腫瘤再增殖的潛力，前人研究也表名其會影響外泌體和miRNA。因此，作者首先在體外測試了阿司匹林治療在腫瘤細胞重塑模型中的作用。發現阿司匹林極大地抑制了與輻射的垂死腫瘤細胞共培養的報告細胞的增殖（圖6a），而當它們單獨培養時對報告細胞的增殖沒有影響。阿司匹林降低了輻射的胰腺癌細胞上清液中的PGE2含量（圖6b），并減少了細胞釋放的外泌體的量（圖6c）。此外，在阿司匹林處理過的輻射細胞衍生的外泌體中，miR-194-5p被下調（圖6d）。與僅接受放射線處理的細胞分泌的外泌體相比，經阿司匹林處理的輻射細胞衍生的外泌體喪失了誘導G1
/ S阻滯并減少EdU摻入的能力（圖6e-f）。因此，經阿司匹林處理的輻射細胞產生的外泌體在輻射后不能促進胰腺癌細胞的集落形成（圖6g）。
接著，作者又在PDX小鼠模型中測試了阿司匹林治療的效果。阿司匹林單一療法對PDX腫瘤無治療作用，單獨放療同樣無治療作用（圖6h-i）。然而，阿司匹林治療和放射療法的結合顯著抑制了腫瘤的重新聚集并延長了荷瘤小鼠的存活時間（圖6h-i）。此外，阿司匹林損害了放療后腫瘤組織的恢復，這與GW4869的作用相似。同時，阿司匹林還抑制了放療后腫瘤組織中ALDH1A1+
TRC的富集。這些數據表明，阿司匹林可抑制胰腺癌放療后的腫瘤再增殖。
圖6：阿司匹林通過削弱垂死的腫瘤細胞的分泌物來抑制放療后的腫瘤
總結
總的來說，本研究通過全轉錄組測序（云序提供）和外泌體miRNA測序（云序提供），鑒定顯著變化的miRNAs。并采用qPCR、Western
blot、IHC、FACS、集落形成等實驗進行分子和細胞分析，發現垂死腫瘤細胞來源的外泌體通過傳遞miR-194-5p誘導G1/S期阻滯，促進DNA損傷反應，提高TRCs的存活率，進而調節E2F3的表達。此外，外泌體miR-194-5P可減輕放療時致癌HMGA2的毒副作用。在潛伏一段時間后，垂死的腫瘤細胞進一步釋放大量的PGE2來恢復TRCs的增殖，并協調了再增殖的級聯反應。值得注意的是，該研究發現小劑量阿司匹林可以通過抑制外泌體和PGE2的分泌來抑制胰腺癌放療后的再生長。
圖7：阿司匹林破壞垂死腫瘤細胞分泌的外泌體導致的腫瘤再生級聯反應
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