為什么QPCR引物設計在跨外顯子的接頭區

如果反轉錄體系里面有基因組殘留，而且你的引物沒有跨內含子，這樣的情況下就很容易造成你的Ct偏小（除了cDNA擴增外，基因組的模板也會作為模板進行擴增，導致模板起始量偏高）；cDNA逆轉后是切除內含子的，而基因組是存在內含子的，如果你的引物設計在了跨兩個外顯子的區域，則只能擴增cDNA而不擴增基因組。
引物不跨外顯子設計也可以，但是必須保證你用的逆轉錄試劑盒里面的gDNA Wiper 可以完全去除你的基因組，你實驗的時候可以做一個NRT的對照看一下有沒有基因組污染。我做好幾個基因的引物就沒有跨外顯子設計，用的是R223 HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA Wiper)，每次NRT也沒有擴增，去除基因組效果不錯。