中科院腦智卓越中心建立跨分化階段高通量譜系示蹤技術

　　 2023年3月18日，《Cell Stem Cell》期刊以封面文章的形式在線發表了中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心（神經科學研究所）、神經科學國家重點實驗室陳躍軍研究組題為《人神經分化過程中跨時間段的克隆譜系追蹤》的研究論文，該研究通過建立能夠跨分化階段高通量譜系示蹤新技術-SISBAR，解析了人多能干細胞分化為人腹側中后腦神經細胞的單細胞譜系，發現了許多新的譜系分化路徑和分子調控機制，研究進一步展示了基于SISBAR技術的新發現在改進帕金森癥細胞治療策略中的應用。SISBAR技術有望為干細胞研究帶來新的突破。

　　發育與干細胞生物學中的一個基礎性問題是如何解析生物體內不同細胞類型之間的發育譜系關系。解析這些譜系關系能夠更加深入地解析生命體的正常發育過程以及病理狀態（包括癌癥與發育障礙）下的分子機制，為操縱在體細胞分化命運，優化體外細胞分化方法，以及促進基于細胞替代療法的再生醫學的發展提供線索。然而，經典的正向譜系追蹤和逆向譜系追蹤方法，主要用于解析同一個分化/發育時間點不同細胞類型之間的譜系關系，而不能同時提供在上一個階段與它們有親緣關系的前體細胞的身份特征。如何持續地追蹤細胞在多個分化/發育時間點的細胞狀態，從而描繪更完整的細胞發育路徑，是發育學領域中亟待解決的問題。

　　針對以上問題，團隊成員通過結合病毒介導的細胞條形碼標記技術、單細胞測序技術，以及克隆分離策略，開發了SISBAR技術，并應用在基于人多能干細胞的神經分化模型中。SISBAR技術可以跨分化階段追蹤單個前體細胞衍生的譜系克隆，同時獲取該前體細胞的單細胞轉錄組信息（圖A）。研究團隊一直致力于人多能干細胞神經分化技術的開發和神經系統疾病的細胞治療研究，建立了將人多能干細胞分化為人腹側中腦和后腦細胞的方法，其中包含能夠用于帕金森癥細胞替代療法的關鍵細胞類型–中腦多巴胺能神經元（2016 Cell Stem Cell； 2021 Cell Stem Cell； 2022 JCI）。

　　團隊成員把SISBAR技術應用于人腹側中后腦的體外分化體系，并建立了“潛能視角”和“起源視角”的譜系分析方法來分別解析由轉錄組定義的不同細胞類型的分化潛能及分化起源，從而構建了一個多層級的譜系樹來描繪整個分化過程（圖B）。這一多層級譜系樹揭示了中后腦細胞分化過程中許多之前未被報道過的發散型和匯聚型跨階段譜系分化路徑。團隊的研究還揭示了跨分化階段的群體水平譜系和克隆水平譜系之間的關系：在發散型譜系關系中，發現同種類型的前體細胞（單細胞轉錄組定義的細胞簇）中單個前體細胞的命運可以不同；不同前體細胞差異的分化命運的集合代表了該前體細胞類型在群體水平的分化命運。在匯聚型譜系關系中，發現同種類型子代細胞中的單個細胞可以有不同的譜系起源，并且這些不同來源的子代細胞會帶有其親代細胞獨特的基因印跡（圖C-D）。

　　研究團隊進一步展示了基于SISBAR技術的跨分化階段譜系關系和相關分子調控機制的解析在神經系統疾病細胞治療中的應用。利用SISBAR技術，研究團隊發現中腦多巴胺能神經前體細胞具有至少三種命運分化潛能，包括中腦多巴胺能神經元、中腦谷氨酸能神經元、血管軟腦膜樣細胞（VLMCs）。研究團隊還鑒定了早期中腦多巴胺能神經前體細胞的特異性表面分子標記物APCDD1（圖E）。將表達APCDD1的神經前體細胞進行流式分選并移植到帕金森病模型小鼠的紋狀體后，移植物中目的細胞-中腦多巴胺能神經元的比例得到了顯著提高（圖F）。并且，與通過SISBAR技術發現的中腦多巴胺能神經前體細胞多分化潛能的結果一致。研究團隊在APCDD1分選的移植物中檢測到了中腦谷氨酸能神經元和一種血管軟腦膜樣細胞的存在，這一結果展示了SISBAR技術在改進細胞治療策略和預測移植細胞體內分化命運中的應用。

　　基于人多能干細胞的細胞替代療法在治療許多用傳統藥物難以治愈的疾病（如帕金森癥）方面具有廣闊的應用前景。然而，人多能干細胞分化得到的供體細胞（細胞藥物）存在顯著的異質性，這將導致供體細胞和移植物中目的細胞的低比例和細胞組成的不穩定性，阻礙了細胞替代療法在臨床上更廣泛地應用。可以預見的是，作為一種通用型技術，SISBAR能夠廣泛地應用于包括神經分化在內的基于人多能干細胞的體外分化系統中，構建整個分化過程的譜系發育樹，解析譜系分化的分子調控機制，使我們更好地理解目的細胞和非目的細胞在分化過程中產生的機制，從而改進細胞治療策略，獲得更安全穩定的細胞治療結果。同時，SISBAR還為我們解析細胞分化/發育過程中的譜系關系提供了新的方法和視角，是經典譜系追蹤方法的重要補充。本研究中群體水平譜系和克隆水平譜系關系的解析，為我們理解細胞分化分過程中復雜而精確的細胞命運決定事件提供了重要的理論基礎。

　　該研究由中科院腦智卓越中心博士研究生游致文與中科院營養健康所王露悅博士，在腦智卓越中心陳躍軍研究員和臨港實驗室魏武研究員的指導下完成，中科院腦智卓越中心何慧博士、吳子彥博士、章馨月、薛帥翔、許培博博士，職工張曉、劉兵，中科院營養與健康所洪延泓，復旦大學腦科學研究院熊曼研究員，復旦大學附屬腫瘤醫院胡欣研究員為本研究提供了重要幫助。本研究得到了中科院、科技部、基金委和上海市科委的資助。