世界首只胚胎干細胞“嵌合猴”誕生

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當期《細胞》封面。神經科學研究所供圖

■本報記者 馮麗妃 張雙虎

經過5年科研攻關，中國科學家培育出世界上首只高比例胚胎干細胞“嵌合猴”。

這只“嵌合猴”由食蟹猴（長尾獼猴）的兩個基因不同的胚胎的細胞培育而來。11月10日，這項由中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心（神經科學研究所）研究員劉真、孫強和中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院研究員Miguel A. Esteban研究組合作完成的研究，以封面論文形式在線發表于《細胞》。

“這是該領域長期追求的一個目標。它毫無疑問是迄今除了嚙齒類動物之外，利用多能干細胞產生嵌合體動物的最佳實證。”該論文多位審稿人如是評價。

中國科學院院士季維智評價該研究是靈長類多能干細胞多能性研究的一個重要突破，為干細胞多能性研究提供了一個重要平臺，也為后續利用干細胞建立疾病猴模型，通過四倍體補償法產生干細胞猴以及體內構建組織器官打下了重要的基礎。

闖過“兩道關”

胚胎干細胞是生命發育早期的“種子”細胞，具有無限自我復制更新的能力和極強的誘導分化發育潛能。這使得它們在細胞治療、器官再生、類器官模型構建等方面發揮著重要作用。

如何證明胚胎干細胞具有多向分化潛能呢？一個“金標準”是將取自一個囊胚的干細胞注射到發育中的另一個囊胚內，形成擁有不同基因型的嵌合體。

“理論上，注射的胚胎干細胞具有很強的體內發育潛能，可以為嵌合體不同器官的發育作出很大的貢獻。”論文通訊作者劉真在接受《中國科學報》采訪時說。

胚胎干細胞的發育多能性已在嚙齒類動物中得到了證明。科學家在1984年首次實現小鼠胚胎干細胞胚胎注射形成嵌合體，于2008年成功實現大鼠胚胎干細胞胚胎注射形成嵌合體。構建非人靈長類胚胎干細胞嵌合體技術對生物醫藥研究具有重要意義，然而相關研究一直進展緩慢。

制造嵌合體，要先把干細胞從囊胚內取出放在體外培養，再把體外擴增培養的胚胎干細胞重新放回囊胚生長發育。“一出一進”之間有兩大難關。

第一大難關是如何獲得具有高效發育潛能的胚胎干細胞。為突破難關，劉真與合作者選擇發育到第7天的食蟹猴囊胚分離干細胞，這個時期的囊胚已經分裂出約100個細胞，每個細胞都具有非常強的分化發育潛能，但尚未開始出現方向性的分化。研究人員將分離的干細胞放在體外培養，讓其保留分裂復制特征，但不再向下分化。

他們最后建立了食蟹猴的9個干細胞系，并將其放置在6種不同的培養體系下對其“健康”進行把關。通過單細胞轉錄組、線粒體代謝、全基因組測序等多方面系統評估，研究人員確定了具有更高多能性、更好傳代穩定性和基因組穩定性的多個干細胞系。

第二大難關是胚胎干細胞注射到受體胚胎后的快速凋亡。為此，研究團隊給選出的胚胎干細胞標記綠色熒光蛋白，以追蹤干細胞存活情況。經過反復實驗、試錯，他們終于找到了既不影響胚胎正常發育，又能保證干細胞存活的最優嵌合胚胎培養條件。

2021年初，闖過上述難關的劉真與合作者把選好的干細胞注射到早期的猴子桑葚期胚胎（發育4~5天的胚胎）中，并將74個具有明顯嵌合的囊胚移植到40只受體雌猴體內，最后獲得了4只流產的胚胎和6只出生的猴子。

這些流產的胚胎或活產的猴子是否都是嵌合體呢？研究人員檢測發現，只有1只流產的胚胎和1只活產的猴子產生了明顯的嵌合。

“所以，做出嵌合體的成功率約40%，做出活產嵌合體的成功率約20%。”論文共同通訊作者孫強對《中國科學報》說。

“雖然效率有限，但結果不算太糟。”劉真說。

這個“不算太糟”的結果就是世界上首只高比例胚胎干細胞嵌合猴，研究人員花費了近3年時間才讓它成功降世。

不可能成功的成功

由于非人靈長類嵌合體培養存在巨大挑戰，2012年，美國科學家在發表于《細胞》的一項研究中曾認為，猴胚胎干細胞不能產生嵌合體，挑戰了靈長類胚胎干細胞多能性理論基礎。

不過，科學家并未放棄嘗試。昆明理工大學的科學家隨后證明猴多能干細胞，包括始發態的多能干細胞，能夠產生嵌合體，但嵌合率僅為0.1%~4.5%。“這表明當時所獲得的多能干細胞與囊胚期的內細胞團或外胚層，仍存在較大差異。”昆明理工大學省部共建非人靈長類生物醫學國家重點實驗室教授李天晴說。

此次，研究人員使用綠色熒光蛋白標簽、基因測序以及其他測試方法，確認了活產猴大腦、心臟、腎臟、肝臟和胃腸道中都含有干細胞來源細胞的組織類型。在不同組織類型中的貢獻從21%到92%不等，在測試的26種不同組織類型中平均為67%。相比之下，那只流產嵌合體猴的平均貢獻比例約為20%。

“這些數據有力地證明了猴子多能干細胞具有在體內分化成各種組織的能力。”論文共同通訊作者Miguel A. Esteban對《中國科學報》說，“這項研究加深了對靈長類動物多能干細胞發育潛力的理解。”

研究人員將取自雌性猴子胚囊的干細胞放入雄性胚胎后，發現盡管最終形成的存活嵌合體是雄性，但其血液細胞、皮膚細胞中檢測出部分雌性基因。

“這很有趣。”孫強說，“它證明了干細胞的分化潛力，也再次證明了胚胎干細胞確實貢獻到了嵌合體猴。”

此外，研究團隊在兩只嵌合體的胎盤組織中都發現了高比例的胚胎干細胞貢獻。考慮到此前小鼠胚胎干細胞幾乎不會貢獻到胎盤組織，說明靈長類胚胎干細胞可能具有獨特的發育全能性。他們在兩只嵌合體猴的生殖細胞中也發現了胚胎干細胞的高比例貢獻，這為構建遺傳修飾模型猴奠定了技術基礎。

“利用靈長類多能干細胞生產嵌合體是這一領域長期追求的目標。原則上，這項研究將為相關基礎研究和非人類靈長類遺傳修飾模型的產生開辟新途徑。具體來說，利用胚胎干細胞實現基因修飾能力，將使完成目前在受精卵或胚胎階段使用CRISPR技術難以實現的研究成為可能。”一位審稿人如是評價。

在“無人區”冒險

作為一名中國本土科學家，劉真從研究生到博士后一直在神經科學研究所工作。他是一名敢于在“無人區”冒險的科學家。

克隆猴是一直以來沒被解決的問題，甚至曾被斷言不可能解決。2018年，仍在從事博士后研究的劉真作為第一作者和導師孫強以封面文章形式在《細胞》發表體細胞克隆猴“中中”“華華”。這一科研成果讓全球科學界矚目。

此外，劉真作為第一作者建立的自閉癥非人靈長類模型、世界首例生物節律紊亂體細胞克隆猴模型先后發表于《自然》《國家科學評論》等期刊。今年4月，他作為通訊作者和團隊在《細胞-干細胞》發表的體外重構非人靈長類類囊胚研究，首次將非人靈長類的類囊胚體外培養至著床后原腸胚時期。英國牛津大學干細胞生物學家Alejandro De Los Angeles評論稱：“這些發現是干細胞類胚胎模型領域的一個里程碑。”

“做科研一定要敢于冒險。”劉真說，“就像研究生入學時，蒲慕明院士講的那樣，要敢于啃‘硬骨頭’。”

“我們的目標不只是一步領先，而是要步步領先。”劉真說。

生命科學前沿的路并不好走。除了科研方面的難題，每一次，劉真與合作者們介紹研究成果時，必然會被“拷問”相關倫理問題。比如嵌合體研究是否會帶來像希臘神話中“奇美拉”一樣的怪物。

對此，劉真表示，相關研究都遵循了國際國內相關程序，確保遠離紅線。

“目前，我們開展的只是基礎科學研究。相關研究未來對基因工程技術發展和瀕危物種保護有實際意義，可以幫助我們構建更精確的猴模型，用于神經系統疾病以及其他生物醫學領域的研究。”他說，比如建立“漸凍癥”動物模型，推動相關疾病治療。

下一步，研究人員希望提升嵌合體猴的培育效率，并進一步探索制約嵌合體猴生存的因素。

據介紹，首只胚胎干細胞系“嵌合猴”僅存活了10天，其背后的原因目前研究團隊尚不清楚。他們僅發現嵌合體中由胚胎干細胞發育而來的細胞和由受體胚胎細胞發育而來的細胞在表觀遺傳修飾上存在一些差別。

“所以，我們要繼續尋找原因。”劉真說。