專欄|液相色譜串聯質譜檢測在黏多糖貯積癥患者診斷與隨訪中的應用

論著

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占霞, 高曉嵐, 季文君, 常思宇, 劉丹, 張惠文. 液相色譜串聯質譜檢測尿黏多糖在黏多糖貯積癥患者診斷與隨訪中的應用[J]. 臨床兒科雜志, 2024, 42(5): 399-406 DOI:10.12372/jcp. 2024.24e0050

ZHAN Xia, GAO Xiaolan, JI Wenjun, CHANG Siyu, LIU Dan, Zhang Huiwen. Detection of urine glycosaminoglycans by liquid chromatography-tandem mass spectrometry in the diagnosis and follow-up of patients with mucopolysaccharidosis[J]. Journal of Clinical Pediatrics, 2024, 42(5): 399-406 DOI:10.12372/ jcp.2024.24e0050

通信作者: 張惠文 電子信箱：zhanghuiwen@ xinhuamed. com.cn

基金資助:    上海市衛生健康委員會臨床專項(202240361)；上海市“科技創新行動計劃”醫學創新研究專項(20MC1920400)    

液相色譜串聯質譜檢測尿黏多糖在黏多糖

貯積癥患者診斷與隨訪中的應用

占 霞¹  高曉嵐¹ 季文君¹  常思宇¹  劉 丹² 張惠文¹

1.上海交通大學醫學院附屬新華醫院兒內分泌遺傳代謝科 上海市兒科醫學研究所（上海 200092）

2.上海愛博才思分析儀器貿易有限公司（上海 200050）

摘要

目的 運用液相色譜串聯質譜（LC-MS/MS）技術建立尿液中硫酸軟骨素(CS)、硫酸皮膚素(DS)和硫酸乙酰肝素(HS)含量的檢測方法，探究該方法在黏多糖貯積癥（MPS）患者診斷及治療隨訪中的應用。

方法 收集20例MPS患兒及37例正常兒童尿液樣本，測定尿液中CS、DS和HS等濃度。尿樣氮氣吹干，鹽酸甲醇衍生化，再次氮氣吹干，復溶后LC-MS/MS分析；評價方法的線性、定量限、精密度、加樣回收率和基質效應。

結果 LC-MS/MS檢測CS、DS和HS的線性均大于0.99。CS、DS和HS的定量下限依次為：0.5、1.0和1.0mg/L。批內不精密度為1.9％~10.4％，批間不精密度為2.6％~9.8％。加標回收率為85.6％~110.4％，相對基質效應為84.9%~115.5%。CS、DS和HS在正常兒童尿液中呈正態分布，以x+1.64SD計算正常兒童尿液中的參考區間上限，分別為16.5、1.8、1.4 mg/mmol。通過分析MPS患兒尿液黏多糖特點，LC-MS/MS法能有效檢出MPS I、MPS Ⅱ、MPS Ⅲ和MPS Ⅵ等MPS患兒。已接受造血干細胞移植的MPS Ⅰ和MPS Ⅱ患兒尿DS、HS水平降低。

結論 LC-MS/MS檢測尿黏多糖性能良好，有望用于MPS患者的精準診斷和治療隨訪監測。

關鍵詞：液相色譜串聯質譜；黏多糖；黏多糖貯積癥

黏多糖貯積癥（mucopolysaccharidosis，MPS）是由于人體細胞溶酶體內降解酸性黏多糖（glycosaminoglycans，GAGs）的水解酶缺乏，不能被完全降解代謝的黏多糖在溶酶體中貯積，可導致患兒身材矮小、面容粗糙、智力語言發育落后、骨骼畸形、肝脾腫大、心臟病變、角膜混濁、氣道阻塞等。根據酶缺陷的類型，MPS分為7個類型，除MPS Ⅱ型為X連鎖隱性遺傳外，其余均為常染色體隱性遺傳。GAGs主要有5種，分別是硫酸皮膚素(dermatan sulfate，DS)、硫酸軟骨素(chondroitin sulfate，CS)、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate，HS)、硫酸角質素和透明質酸^[1]。GAGs是MPS患者由于溶酶體酶活性缺乏而累積的直接底物，尿液GAGs分析可為MPS的確診和分型提供依據，也可用于監測疾病進展和治療效果，如造血干細胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，HSCT）和酶替代治療的療效評估^[2-3]。

目前國內開展GAGs檢測的實驗室少，且多為定性分析。GAGs定性檢測常用甲苯胺藍斑點法和醋酸纖維薄膜雙向電泳或瓊脂糖凝膠電泳法^[4-5]。前者方法簡便，但無法區分不同類型的GAGs。電泳法能將CS、DS和HS條帶分離，但濃低度的GAGs樣本可能觀察不到條帶，且無量化數值^[6]。定量檢測常用1,9-二甲基亞甲藍比色法，該方法染料和離子的結合特異性較低，且不能區分GAGs的類型，只能用于MPS患者高濃度的總GAGs含量檢測[7]。目前研究MPS的治療方案越來越多，判定療效的一個重要指標是尿中不同類型GAGs含量的變化。本研究運用LC-MS/MS技術建立尿CS、DS和HS的定量檢測方法，為MPS的診斷及治療隨訪提供依據。

1  對象與方法

1.1  研究對象

共收集20例2022年2月至2023年6月在上海交通大學醫學院附屬新華醫院就診的MPS患兒，15月齡~9歲，其中男15例，女5例，留取該20例患兒的晨尿樣本。收集正常兒童晨尿樣本37例，男21例，女16例，1月齡~15歲。

另外收集1例基因篩查懷疑MPS Ⅲ A型的患兒尿液樣本，男，出生后24小時黃疸住院，直接膽紅素高；2月齡時于新華醫院就診。所有檢查獲得患兒或其監護人的知情同意。本研究通過醫院醫學倫理委員會批準（No.XHEC-D-2023-181）。尿液樣本均存放于-80℃保存待用。

1.2 儀器與試劑

采用儀器包括超高效液相色譜串聯質譜聯用儀（Triple Quad^? 4500 MD，美國SCIEX公司)，24孔氮氣吹干儀(美國Organomation公司)，恒溫箱（Ventivell公司）。標準品CS、DS，購自United States Pharmacopeia公司；HS購自Sigma-Aldrich公司；甲酸、醋酸銨、四氘代甲醇、2，2 -二甲氧基丙烷、乙酰氯、氯代十六烷基吡啶購自美國Sigma-Aldrich公司；質譜級甲醇、乙腈購自美國Merck公司。

1.3 尿液黏多糖檢測

1.3.1 標準品溶液和質控品的制備 混合標準品溶液的濃度：DS為1、2、5、20、50、200、500 mg/L；CS為0.5、1、2.5、10、25、100、250 mg/L；HS為1、2、5、20、50、200、500 mg/L。選擇正常人尿液作為基質配制低、高濃度質控品，標準品添加濃度為CS（2.5和25 mg/L），DS（5和50 mg/L），HS（5和50 mg/L）。

1.3.2 氘代同位素內標的制備 將160μL乙酰氯滴加到1mL氘代甲醇中，制備成2mol/L氘代鹽酸甲醇；分別取15、30和60μL的CS、DS和HS標準品溶液（濃度為10 g/L），氮氣吹干；加入300 μL 2mol/L氘代鹽酸甲醇；65℃，75min衍生；氮氣吹干，-80℃保存待用；使用前水稀釋配制內標工作液，濃度為D6-CS：1.5mg/L；D6-DS：3.0mg/L；D6-HS：6mg/L。

1.3.3 樣品處理 尿液樣本離心，轉速2000×g，取20μL上清液氮氣吹干；添加10μL 2，2-二甲氧基丙烷，200μL鹽酸甲醇衍生，65℃，75min，氮氣吹干；加入內標工作液復溶樣本，LC-MS/MS檢測上述復溶樣品。

1.3.4 液相色譜及串聯質譜方法 采用飛諾美色譜柱Kinetex C8 ( 2.1mm×100mm，2.6μm)，流動相A為 H₂O 含 5mmol/L 醋酸銨和0.1%甲酸 ；流動相B為MeOH含5 mmol/L 醋酸銨和 0.1% 甲酸；采用梯度洗脫：0~1.5min, 95~90% A；1.5~2.8min, 90%~87%A；2.9~3.1min, 87%~5% A；3.1~4.0min, 5%A。流速為0.3 mL/min，柱溫為40 ℃，進樣體積為 1μL。采用電噴霧電離陽離子、多反應監測的質譜模式采集數據，離子源溫度 500℃，霧化氣50psi；輔助氣50psi；氣簾氣30psi；電噴霧電壓5500V；定量離子對為CS，426.1/236.1；DS，426.1/236.1 ；HS，384.2/161.9 ；D6-CS，432.1/239.1 ；D6-DS，432.0/239.1 ；D6-HS，390.2/161.9。

1.3.5 性能驗證 性能驗證過程參考《液相色譜-質譜臨床應用建議》、《液相色譜串聯質譜臨床檢測方法的開發與驗證》等指南^[8-9]。將黏多糖標準品溶液連續檢測3天