不連續非變性凝肢電泳實驗

非變性凝膠電泳通常是在高 pH（8.8）緩沖液條件下進行。這時，多數蛋白質帶負電荷，并向陽極遷移。

蛋白質溶液

丙烯酰胺 雙丙烯酰胺 Tris 堿 鹽酸 過硫酸銨 TEMED 甘氨酸 甘油 溴酚藍 甲醇 冰醋酸

Bio-Rad Min-Protean II 凝膠電泳槽 微量注射器或微量加樣器 染色和脫色用的小容器

1. 工作溶液配制

2. 工作溶液用量

（1）制備不同厚度電泳凝膠所需的溶液體積

制備兩塊 6 cm×8 cm 的凝膠

配制量應比實際用量稍多些。

（2）X％ 分離膠的計算

3. 制備分離膠

（1） 按操作指南裝配好灌膠用的模具；

（2） 將 A 液、B 液和水在小的三角瓶或試管中混合（由于丙烯酰胺具有神經毒性。 應戴手套操作）；

（3） 在溫和攪拌下，加入過硫酸銨，TEME 混勻。由于這一步中發生聚合，動作要迅速；

（4） 將上述膠液用滴管移入凝膠模具；

（5） 加完分離膠后，立即輕輕在其頂部覆蓋 1～5 mm 的水垣；

（6） 靜置 30～60 min，待凝膠聚合；當凝膠聚合后，在分離膠和水層之間將出現一個明顯的界面，這時將凝膠稍微傾斜。 判斷凝膠是否聚合。

4. 堆積膠的制備

（1） 除去覆蓋在分離膠上的水層；

（2） 在小三角燒瓶或試管中，將 A 液，C 液和蒸餾水混合；

（3） 在溫和攪拌下，加入過硫酸銨和 TEMED，混合均勻；

（4） 吸取堆積膠溶液加到分離膠之上，直至溶液到達前玻璃板的頂部。

（5） 將梳子小心的插入到兩塊板之間，直至梳子齒底部到達前玻璃板的頂部，在梳子齒端避免留下氣泡。

（6） 放置 30 min，堆積膠可聚合；

（7） 待堆積膠聚合后，小心的取出梳子，不要使加樣孔裂縫；

（8） 將凝膠置入電泳槽中，并接好正負電極；

（9） 將電泳緩沖液加入內外電泳槽中。 確保凝膠的上部和底部都浸在緩沖液中。

5. 樣品制備

（1）加樣孔的樣品容量（Mini-Gel 系統）

（2） 將蛋白質樣品和樣品緩沖液（20 ul + 5 ul）在 Eppendorf 管中混勻；

（3） 用微量注射器將樣品加入加樣孔中；

（4） 在加入不同的樣品之前。用注射器抽吸少量的電泳緩沖液沖洗注射器，以避免樣品間的相互污染。

6. 電泳

（1） 將電極插頭與適當的電極相接，對于體育 pH 8.8 的凝膠，電流應流向陽極；

（2） 將電壓調至 100～200 V；

（3） 電泳值示蹤染料的前沿遷移到距凝膠底部約 1～5 mm處；

（4） 關閉電源；

（5） 拔掉電極插頭；

（6） 取出電泳凝膠板，放在一個安全的地方，輕輕撬開凝膠兩邊的玻璃板，使膠粘在其中的一塊板上。

7. 凝膠染色

（1） 戴手套，將凝膠轉移到一個含有約20 ml考馬斯亮藍的培養皿內；

（2） 在搖床上緩慢震蕩，0.75 mm 的膠需要 5～lO min。1.5 mm 的凝膠需要 10～20 min，；

（3） 去除染液；

（4） 加入約 50 ml 脫色液，繼續輕微震蕩；

（5） 為了脫色完全，需數次更換脫色液并震蕩過夜；可進行干膠保存。