三十五項淘汰臨床檢驗項目、方法及替代實驗(18)

關于淘汰黃疸指數及凡登白試驗

淘汰黃疸指數及凡登白試驗，采用血清總膽紅素和直接膽紅素測定

一、為什么淘汰黃疸指數及凡登白試驗

　　黃疸指數是1919年Meu　l　engracht 提出跟據血清黃色深淺程度來判斷血清膽紅素水平的一種方法。規定血清黃色色度相當于1：10000的重鉻酸鉀溶液的色度為一個黃疸指數單位。用目視比色法，比較粗糙，受主觀因素影響較大。同時由于膽紅素與重鉻酸鉀色澤的差異、血脂及血清中色素，尤其胡羅卜素的干擾，使判斷結果常有誤差。雖然有人改用光電比色法，但由于重鉻酸鉀與膽紅素的吸收光譜不同，結果相差很大。國際上已經淘汰此方法。衛生部臨床檢驗中心血清總膽紅素測定專題協作組于1984年推薦改良Jendrassik—Grof法（J—G法)測定血清總膽紅素，1983年美國臨床化學學會(AACC)膽紅素標準委員會科研小組也推薦J－G法為測定膽紅素的侯選參考方法。因此建議采用J—G法測定血清膽紅素。近年來發展的特異性高的膽紅素氧化酶法測定血清總膽紅素，是一個有前途的測定方法，在有條件的實驗室可以試用。

　　1983年Ehrlich利用重氮反應檢測尿中膽紅素。此后，這一反應一直用于血清膽紅素測定。膽紅素在血清中以結合和非結告兩種形式存在。結合膽紅素溶于水，能與重氮試劑直接作用生成紫紅色偶氮膽紅素，亦稱直接膽紅素。非結合膽紅素不溶于水，只有在有機溶劑(作促進劑)中方能與重氮試劑反應，生成偶氮膽紅素。利用血清膽紅素這一性質，對黃疸進行鑒別，此試驗稱凡登白(Van den Bergh)試驗。血清與重氮試劑直接作用如出現紫紅色，為凡登白直接反應陽性，表示結合膽紅素增高：根據呈色反應的速度又分為直接即刻反應，直接延遲反應。不呈色者為直接陰性反應表示結合膽紅素不增高。再加入有機試劑(為乙醇)后，如仍不呈色為間接反應陰性，如顯紅色為間接反應陽性，表示非結合膽紅素增高。如直接試驗陽性的標本加入有機試劑后，紅色再加深為雙相反應，表示血清中結合及非結合膽紅素都增高。事實上在判讀結果時標準很難一致。更重要的是重氮反應的速度受很多因素影響，如重氮試劑中的對氨基苯磺酸和亞硝酸鹽濃度高時反應快，鹽酸濃度高時反應慢。試劑配制的時間，血清中不同組分膽紅素的比例對呈色速度都有影響，難以得到準確結果。同時實驗結果對黃疽鑒別的意義亦不夠明確。國際上早已廢用，故應淘汰。用血清總膽紅素及直接膽紅素測定能更準確地反映血清膽紅素的含量。

二、血清總膽紅素和結合膽紅素測定 (改良J—G法或稱咖啡因法)

(一)原理

　　測定結合膽紅素，血清與重氮苯磺酸混合，生成偶氮膽紅素。在沒有咖啡因—苯甲酸作促進劑的條件下，只有結合膽紅素與重氮試劑作用。加入抗壞血酸(或疊氮鈉)終止反應。繼續加堿性酒石酸溶液和咖啡因試劑，pH增高使偶氮膽紅素呈蘭色，吸收峰續從585nm移至600nm，測定更敏感。

　　測定總膽紅素時，血清先加入咖啡因試劑(促進劑)再加重氮苯磺酸。在反應時，血清結合及非結合膽紅素同時與重氮試劑反應生成偶氮膽紅素，在室溫放置10分鐘后加入抗壞血酸(或疊氮鈉)、堿性酒石酸試劑及稀鹽酸生成偶氮膽紅素。在600nm下測吸光值。

(二)試劑：

1．咖啡因試劑

　　無水醋酸鈉82g，苯甲酸鈉75g，二乙胺四乙酸二鈉(EDTA·Na₂)1g，溶于約500ml蒸餾水中。再加入咖啡因50g，攪拌至完全溶解(注：加入咖啡因后不能加熱溶解)。然后加蒸餾水稀釋至1000ml，混勻。用濾紙過濾，置棕色緊塞試劑瓶內，室溫保存，可穩定6個月。

2．堿性酒石酸鈉溶液

　　迅速稱取氫氧化鈉75g，酒石酸鈉(Na₂C₄H₄0₆·2H₂0)263g，用蒸餾水溶解，待溶液變冷后，補足至100ml，混勻，置塑料瓶中室溫保存，可穩定6個月。

3．5g／L亞硝酸鈉溶液

　　稱取亞硝酸鈉0.5g，加蒸餾水溶解并稀釋至lOOml，混勻。此液為儲存液，置棕色緊塞試劑瓶中4℃保存，三個月內有效。若發現溶液呈淡黃色時，應廢棄重配。

4．5g／L對氨基苯磺酸溶液

　　稱取對氨基苯磺酸(NH₂C₈H₄SO₃H·H₂0)5 g，溶于約800 ml和5g／L蒸餾水中，加濃鹽酸15ml，待完全溶解后，加蒸餾水至1000ml。

5．重氮試劑

　　臨用前將5g／L亞硝酸鈉溶液0.5ml和氨基苯磺酸溶液20ml，混合后使用。

6．5 g／L疊氮鈉溶液

　　稱取疊氮鈉0.5g，用蒸餾水溶解并稀釋至100ml。

7．342μmo／L(200mg／L)膽紅素標準液。將膽紅素純品(注1)在真空干燥器干燥24小時后，精確稱取20mg于稱量瓶內，加入濃度為二甲亞砜4ml溶解，用玻棒攪拌呈混懸狀，加入濃度為0.1mmol／L的Na₂CO₃溶液2ml使膽紅素完全溶解，并傾入100ml容量瓶內，必要時用二甲亞砜沖洗附在稱量瓶壁上的膽紅素，緩緩加入經檢驗合格的稀釋用血清(注2)約80ml，：邊加邊搖，但勿太用力以免產生氣泡。再加入0.1mol／LHCl　2ml，最后加入稀釋用血清至刻度，混勻，配成200mg／L膽紅素標準液。整個配制過程應盡量避貯存容器用黑紙包裹，置4℃可保存三天。

　　[注1]配制膽紅素標準液的純品，其氯仿溶液摩爾吸光系數在60700±1600范圍內。

　　[注2]稀釋用血清可收集多份無溶血、無黃疽、無脂濁的新鮮人血清，混合，如有絮狀混濁可用蔡氏濾器過濾，混合血清應達到下述條件：取血清1.0ml加新鮮配制生理鹽水24.0ml稀釋，置入光徑為10mm比色杯內。用同一生理鹽水校正吸光值為“0”，用波長414nm讀取稀釋的血清吸光值應<0.100，用波長460nm讀吸光值應<0.040。

(三)操作

1．血清總膽紅素及結合膽紅素測定

　　取16X100mm試管，按表1加液操作

　　表1　血清膽紅素測定操作步驟

　　充分混勻，按血清總膽紅素方法進行測定，每一濃度平行做三管，求其均值。每管還應減去稀釋用混合血清的總膽紅素吸光值，然后對相應的膽紅素濃度作圖，繪出校準曲線。

(四)參考值

　　血清總膽紅素：5.1～17.1μmol／L(0.3～1.0mg／d1)
　 血清結合膽紅素　0～6μmol／L<0～0.35mg／d1)

　　慣用單位與法定單位的換算：
　　 膽紅素mg／d1＝膽紅素μmol／L　×0．0585

(五)附注：

1．本法在10—37℃范圍內測定，不受溫度變化影響，兩小時內呈色非常穩定。

2．本法的靈敏度高，藍色偶氮膽紅素摩爾吸光系數(ε)74380±866

3．輕度溶血（含血紅蛋白≤1000mg／L時)對本法測定結果無影響，但溶血超過此范圍時，可使結果偏低。

4．膽紅素與重氮試劑作用的反應速度由很多因素決定。其中重氮試劑的兩種溶液組分是一個重要因素。一般而言，對氨基苯磺酸和亞硝酸濃度增加，反應增快，鹽酸濃度增加，反應變慢。

5．測定結合膽紅素的反應時間不同可得到不同的結果，文獻報導，反應一分鐘的吸光值的結果有較大的誤差。由于膽紅素和重氮試劑作用是一個動態過程，不同時間比色，結果自然會有差異

6．疊氮鈉能破壞重氮試劑，終止重氮反應，故不能用含有疊氮鈉作防腐劑的質控血清，否則可使反應不完全，甚至不呈色。

三、酶法膽紅素測定：

(一)原理

　　在酶法膽紅素測定中，反應如下

　　　　　　　 　　膽紅素氧化物
　　膽紅素+1/2O₂ ---------------→膽綠素＋H₀

　　膽綠素+O₂---→無色化合物

　　在460nm波長，吸光度的下降值(△A)與血清中膽紅素濃度成正比。

(二)試劑

1．0.1mol／L　Tris緩沖液(pH8.2)

　　Tris 1.211g，膽酸鈉172.3mg和SDS 432.6mg溶于約90ml蒸餾水中，在室溫用lmol／LHCL調至pH 8.2，再加蒸餾水至100mL。此緩沖液含4mmol／L膽酸鈉和15mmol／LSDS，置冰箱保存。

2．膽紅素氧化酶　酶活力為25000U／L．

3．342μmol／L膽紅素標準液　配法見改良J-G法測定。

(三)操作：

1．按表3加入相應試劑

　表3　酶法膽紅素測定操作步驟

　　加入膽紅素氧化酶后立即混勻，各管置37℃水浴15分鐘，用分光光度計，在波長460nm以蒸餾水調零，分別讀取各管吸光度A_S，A_SN，A_E及A_EB。

2．計算：

　　測定管凈吸光度△A_E＝A_EB—A_E
　　標準管凈吸光度△A_S＝A_SS—A_S
　　　　　　　　　　　　　　　△A_E
　　血清總膽紅素mmol／L＝------------×342
　　　　　　　　　　　　　　　△A_S
　　　　　　　　　　　　　　　△A_E
　　血清總膽紅素mg／d1＝-------------×20
　　　　　　　　　　　　　　　△A_S

3．標準曲線繪制務必于配制膽紅素標準液的當天繪制標準曲線，配制不同濃度的膽紅素標準液(見J—G法)，按表 3操作。各標準管的凈吸光度(△A_S)與對應的標準液濃度作圖，繪制標準曲線。

(四)附注：

1．干擾因素

　　Perry測試了氨芐青霉素、慶大霉素、咖啡因、苯巴比妥、安定及茶堿等17種治療藥物和EDTA、氟化物、肝素鈉等抗凝劑，沒有發現對酶法膽紅素測定有干擾。實驗資料表明，血清中Hb濃度在1.0g／L以下，對膽紅素測定結果影響不大，Hb濃度大于1.5g／L以上，膽紅素測定結果明顯下降。

2．線性范圍

　　據報道本法線性范圍至少可達513μmol／L。